Manual de Parasitología general

RECOLECCION, MANEJO Y CONSERVACION DE PRODUCTOS BIOLOGICOS

INTRODUCCION

 

     La Parasitología Clínica  estudia principalmente la relación entre el hombre y las especies parasitarias dependientes de él, las cuales en su gran mayoría suelen actuar como agentes patógenos.

 

     El estudio de la Parasitología médica es importante para establecer el diagnóstico de la parasitosis humana, ya que en muchos casos, el establecimiento, multiplicación y difusión de los parásitos en el organismo, son causa de lesiones y alteraciones funcionales que pueden llegar a ser graves, manifestándose como enfermedades parasitarias.

 

En la importante función de la medicina actual, de diagnosticar, tratar y prevenir la parasitosis humana, es imprescindible la intervención y ayuda del Laboratorio Clínico que cuenta con una serie de métodos eficaces y apropiados para la detección de estos organismos nocivos al hombre, ya que el tratamiento médico adecuado  que se va a administrar a un individuo infectado, no debe basarse sólo en los datos obtenidos a partir de la sintomatología, pues en parasitosis causadas por diferentes agentes, se observan manifestaciones muy similares, y en muchos de los casos, los síntomas presentados por el paciente, son demasiado escasos para establecer el diagnóstico de certeza.

 

     Debido a que es importante que el futuro Químico Clínico cuente con una fuente de consulta a este respecto este Manual de Prácticas de Laboratorio de Parasitología Humana tiene la finalidad de reunir métodos básicos y eficaces en el diagnóstico de parásitos, que al mismo tiempo sean accesibles para nuestra Facultad.

 

    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RECOLECCION, MANEJO Y CONSERVACION DE PRODUCTOS BIOLOGICOS

 

Generalidades

 

En el manejo de los productos biológicos es donde va a radicar el éxito o fracaso de un diagnóstico en enfermedades parasitarias. Es necesario seguir ciertos lineamientos preestablecidos para cada producto ya que las muestras mal recolectadas, inadecuadamente conservadas y con mucho tiempo después de haber sido obtenidas, no servirán para observaciones y estudios ulteriores, e inclusive pueden conducir a resultados erróneos o falsos.

 

MATERIA FECAL

 

Recolección. La obtención de la materia fecal puede hacerse de diferentes manera:

a)    Expulsión natural: La más frecuente

b)     Purgantes: En casos muy especiales de amebosis intestinal crónica y en estrongiloidosis.

c)    Cucharilla rectal: En recién nacidos o lactantes

 

Manejo. Se deben utilizar frascos limpios de boca ancha de preferencia con tapas de rosca, se evitará la contaminación con tierra, agua u orina. Los frascos se guardarán en lugares frescos pues con el calor se acelera el fenómeno de fermentación y con el frío se pueden destruir quistes y trofozoitos de protozoos, deberán de etiquetarse con los datos del paciente nombre, edad, sexo, fecha y hora de expulsión de las heces.

 

Conservación. Los conservadores pueden ser físicos o químicos. Los medios físicos son las temperaturas bajas, de 10º C que es la temperatura del refrigerador; se utiliza sobre todo para heces formadas, las cuales incluso pueden llegar a examinarse 24 y 48 horas después de evacuadas, lo que no sucede con las heces diarreicas, que deben examinarse en un plazo no mayor de una hora y no deberán refrigerarse. Los medios químicos permiten la conservación de las muestras durante un tiempo mayor, sin correr el riesgo de que las formas parasitarias se deformen o destruyan. De los conservadores y preservadores más utilizados son:

 

·         Solución de formalina *  al 10%

       Se disuelven 10 ml de formaldehido en 90 ml de agua de la llave y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.

*Se denomina así a la solución de formaldehido al 39% que los laboratorios de productos químicos etiquetan como formol, aldehido fórmico o formaldehido

·         Solución de formalina al 5%

La solución de formalina al 10 % está indicada para preservar muestras en las cuales se desconoce su contenido parasitario, para usar adecuadamente esta solución, se mezcla una parte de heces con tres de la misma. Debido a que el formol es el conservador ideal para quistes, huevos y larvas, se debe de escoger la parte más consistente de la muestra.

·         Solución de merthiolate-yodo-formaldehido (MIF). Esta solución preservadora que a la vez fija y tiñe quistes y trofozoitos de protozoos intestinales y huevos y larvas de helmintos; tiene varias ventajas que lo recomiendan : preparación simple, bajo costo, proceso de fijación rápido y su calidad conservadora permite el almacenamiento de especímenes durante tiempos prolongados.

·         Fijador de Fenol, alcohol y formol. Esta solución conserva adecuadamente trofozoitos y quistes de protozoos, así como huevos y larvas de helmintos. El material previamente preservado con PAF se puede utilizar para hacer lecturas inmediatas con y sin tinción temporal.

·         Fijador de glicerina al 50%. La glicerina es un excelente conservador para un gran número de  huevos de helmintos , uno de los inconvenientes es aclarar demasiado las formas parasitarias y se obtienen muy pobres resultados para quistes y trofozoitos de protozoos.

·         Fijador de Schaudinn.Este fijador es excelente para conservar todos los tipos de formas parasitarias, trofozoitos, quistes , huevos y larvas.

·         Fijador de alcohol polivinílico (PVA) Sirve para conservar y fijar todos los tipos de formas parasitarias.

 

EXPECTORACION

 

 Debe recogerse muestras de esputo si se sospecha parasitación por Paragonimus mexicanus, Strongiloides stercolaris, Pneumocystis carinii; se puede obtener la muestra en forma natural, se le indica al paciente que tosa y recolecte el producto en un frasco de boca ancha, previamente proporcionado, en individuos hospitalizados se puede hacer la toma con broncoscopio y al hacer el neumólogo esta exploración tomará la muestra para el laboratorio; se utiliza también para este tipo de pacientes, el escobillón retrofaríngeo y lavado bronquial.

 

Manejo: Los frascos con las muestras deberán etiquetarse con los datos del paciente, fecha y hora de recolección

 

Conservación. De preferencia los exámenes de estos productos biológicos se deben llevar a cabo en cuanto se concentren en el laboratorio, en caso de retraso es conveniente conservarlas con solución de formaldehido al 10%.

 

ORINA Y EXUDADOS VAGINAL Y URETRAL

 

La orina se recolecta, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis, la primera de la mañana y de preferencia la primera parte de la micción. El exudado vaginal  también se recolecta para el mismo objetivo, en un tubo con 1 ml de sol. Salina isotónica; se recomienda el uso de espejo vaginal para poder tomar la muestra del fondo de saco posterior de la vagina. El exudado uretral se toma directamente de la uretra si es muy abundante y hay escurrimiento, en caso contrario se tendrá que dar masaje prostático. También se recolecta en 1 ml de solución salina isotónica.

 

Manejo. Los tubos con los exudados y frascos con orina, deberán etiquetarse con el nombre, sexo y edad del paciente. De preferencia se anotará la hora de la toma de muestra.

 

 Conservación. Para este tipo de muestras no se utilizan conservadores pues los trofozoitos de Trichomonas vaginalis son muy lábiles, de preferencia se harán los estudios de inmediato.

 

SANGRE

 

Recolección. La obtención de sangre, según la cantidad que se requiera, se puede hacer por punción venosa o por punción en el dedo o en lóbulo de la oreja. Cuando se van a hacer cultivos, sólo será necesario hacer una buena asepsia y trabajar al lado de un mechero. Ocasionalmente será necesario recolectar la sangre en tubos y llevarla a un laboratorio de Parasitología de referencia para la búsqueda de parásitos en ella.

 

Manejo. Generalmente la sangre recolectada en forma de frote y gota gruesa, se hace en la misma laminilla, se puede anotar el nombre en el frote con el ángulo de un porta o también escribirlo con lápiz punta de diamante;cuando se utilizan tubos estos se etiquetarán o con plumón indeleble se colocarán los datos del paciente.

 

Conservación. Cuando la sangre va a ser transportada de un lugar a otro y se corre el riesgo de descomposición, se utiliza azida de sodio como conservador, en el caso que no exista el problema de la descomposición, se utilizará solamente el anticoagulante.

 

Anticoagulantes

·          Mezcla de oxalatos. La solución de oxalatos es un excelente y muy económico anticoagulante, de uso universal.

·         Citrato. Se pueden utilizar citratos de sodio o potasio, dan prácticamente los mismos resultados que los oxalatos, también son muy económicos.

·         EDTA. Es excelente porque las muestras no se alteran prácticamente en volúmen.

·         Heparina.Se conserva el volúmen de la muestra.

·         Desfibrinación. El inconveniente es que se pierden grandes volúmenes de sangre desfibrinada en el coagulo junto con las perlas de vidrio.

 

TEJIDOS

 

Recolección. Los productos de biopsia, extirpaciones y necropsias, inmediatamente se colocarán  en frascos apropiados que han sido preparados de antemano con el fijador. En caso de que se requieran cultivos, pequeñas porciones de tejido se colocarán en el medio apropiado.

 

Manejo. Tanto los frascos con los tejidos, junto con los tubos con los medios  se etiquetarán con los datos del paciente.

 

Conservación. El líquido fijador es formaldehido al 10%, hecha con agua destilada y neutralizada con óxido de calcio, conserva y fija los tejidos durante mucho tiempo.

 

PARASITOS:

Recolección. Es común que la obtención de parásitos sobre todo de helmintos, los haga el paciente. Casi siempre llegan con el médico con un frasco con agua o alcohol con el parásito. También se pueden recolectar parásitos de los tamizados.

 

Manejo. Los parásitos se colocan en frascos con cierre hermético, se etiqueta con los datos del paciente.

 

Conservación. Las soluciones preservadoras más usadas son las de formol al 10% y la de alcohol al 70%; la que se prefiere es la última ya que cuando se trata de proglótides de Taenia se puede proceder, aún con el alcohol a utilizar un fijador para su posterior tinción, pues los parásitos conservan su suavidad, mientras que con el formol se endurecen demasiado. Existe un fijador a base de alcohol, formaldehido y ácido acético en agua, que se puede utilizar como un excelente conservador, de hecho, después de hacer la fijación, los especímenes se guardan en esta solución que se conoce como AFA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

HARADA- MORI

OBJETIVO: Realizar cultivo de huevos para obtener desarrollo de larvas y así poder precisar la especie.

GENERALIDADES: Los huevos uncinariformes observados en muestras fecales pueden ser difíciles o imposibles de diagnosticar, mientras que las larvas que surgen de ellos se identifican fácilmente. Un problema práctico frecuente es la diferenciación de las infecciones por Necator de las producidas por Ancylostoma. Para cultivar larvas a partir de huevos, Harada y Mori (1955) describieron un método sencillo y limpio en tubos de ensaye.

MATERIAL Y EQUIPO:

  • Agua Destilada
  • Tubos de ensaye de punta cónica de 15 ml
  • Gradilla
  • Abatelenguas o aplicadores de madera
  • Tiras de papel filtro de 13 X 120 mm
  • Portaobjetos de 26 X 76 mm
  • Cubreobjetos de 22 X 22 mm
  • Pipetas Pasteur con bulbo
  • Sol. De lugol o ácido acético al 20%
  • Microscopio

METODO:

1.- Se extiende una fina película de heces ( de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro.

2.- Se coloca el papel en un tubo de ensaye con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo.

3.- Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28°C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 días añadiendo agua según se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro.

El flujo capilar del agua que sube a través del papel y la película fecal mantiene húmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depósito oscuro. Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de ésta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscópico. La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la película fecal. Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a baño María (50-60°C) o añadiendo una cantidad de ácido Acético al 20%.

 

 

 

                  

 

                             Strongyloides              Necator                Ancylostoma

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            


 

                               

 

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

OBJETIVO: Realizar un método de sedimentación con gran sensibilidad para detectar infecciones leves.

 

GENERALIDADES: En 1917 Carles y Barthelemy describieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde, en 1948 Ritchie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas.

     El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

 

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopio
  • Centrífuga
  • Tubos de ensaye cónicos de 15 ml
  • Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado
  • Embudos de polietileno
  • Vasos de precipitado de 50 ml
  • Aplicadores de madera
  • Pipetas Pasteur con bulbo
  • Portaobjetos de 26 X 76 mm
  • Cubreobjetos de 22 X 22 mm
  • Solución salina  isotónica
  • Solución de formaldehído al 10%
  • Éter etílico comercial

 

METODO

1.- Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza.

2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.

3.- Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm.

4.- Se decanta el sobrenadante  y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min.

6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm.

8.- Después de centrifugar se observan 4 capas:

a)    éter en la superficial,

b)    un tapón de restos fecales,

c)    formaldehído,

d)    sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos.

10.-Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el  mismo.

11.-Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

12.-Se anotan resultados de observación y hacer dibujos.

 

 

 

INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM

 

OBJETIVO: Conocer los procedimientos de laboratorio útiles en el diagnóstico  del paludismo ya que podemos encontrarlo en forma aislada en nuestro país.

 

GENERALIDADES: El procedimiento para el diagnóstico de protozoos en sangre circulante es el estudio al microscopio de preparaciones en portaobjetos las cuales son la extensión fina y la gruesa. La extensión fina ideal es la que tiene el grosor de una célula y en la que los elementos celulares aparecen algo aplanados. La extensión fina es útil para estudiar detalles de los hematíes y de los parásitos de la sangre, su principal limitación es que la cantidad de sangre presente en la muestra es pequeña.

     La extensión gruesa contiene 6-20 veces más sangre por unidad de superficie que la extensión fina. Es fundamental que no se fije antes de la tinción ya que los hematíes tienen que deshemoglobinizarse durante el procedimiento. La rotura de los hematíes y la pérdida de su hemoglobina permite la visión microscópica de las demás estructuras, incluidos los parásitos sanguíneos, aunque se encuentren en la parte más profunda de la extensión. La extensión gruesa resulta útil para el diagnóstico rápido de las parasitemias demasiado leves para apreciarse en la extensión fina, pero no sirve para estudios anatómicos finos.

     La toma de sangre periférica para Plasmodium vivax y P. Malarie  deben efectuarse cuando el paciente presenta escalofríos para la búsqueda de esquizontes maduros. Para P. Falciparum se debe tomar la muestra después del acceso febril para observar los eritrocitos con varios trofozoitos antes que estos desaparezcan en capilares de órganos internos.

     Con el colorante Giemsa las estructuras se tiñen de la siguiente manera:

Plasmodium: Citoplasma azul o azul grisáceo.

Eritocitos: Azulosos, grisáceos y en ocasiones rosados.

Núcleo de los Leucocitos: Violeta o morado.

Plaquetas: Violeta ligero o rosa pálido.

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopios
  • 2 portaobjetos limpios y desengrasados
  • 1 lanceta desechable
  • Puente de tinción
  • Caja de Petri
  • Pipeta Pasteur con bulbo
  • Torundas de algodón con alcohol al 70%
  • Sol. Colorante de Giemsa
  • Alcohol metílico
  • Aceite de inmersión
  • Agua destilada
  • Algodón
  • Preparaciones teñidas de Plasmodium

METODO

1.-   En cada mesa se seleccionará un alumno, para puncionar el dedo pulgar o el lóbulo de la oreja previa asepsia de la región con alcohol al 70%. Una vez que se evapora el alcohol se realiza la punción, colocando 3 a 4 gotas de sangre en un extremo del portaobjetos y una gota pequeña en el extremo opuesto.

2.- Las 3 gotas se extienden con el canto de otro portaobjetos y la gota se redondea con uno de los ángulos de dicho portaobjetos a dejarla de 1 cm de diámetro.

3.-  Dejar secar las dos preparaciones a temperatura ambiente durante una hora y media, para que se fije bien la gota gruesa.

4.-  Una vez seca la preparación fina cubrir con alcohol metílico durante uno o dos minutos, procurando que no toque el alcohol a la gota gruesa.

5.- Pasado este tiempo, desechar el exceso de alcohol y dejar secar por evaporación.

6.-   Colocar algodón húmedo en la caja de Petri y encima el frotis.

7.-   Cubrir el frotis con colorante de Giemsa.

8.-  Taparlo para evitar que se seque, dejar actuar el colorante durante 10 minutos.

9.    Lavar con agua destilada.

10.  Escurrir y dejar secar.

11.-  Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a este ultimo aceite de inmersión.

12.-  Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

 

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN WILLIS

 

OBJETIVO: Realizar método de concentración por flotación simple.

GENERALIDADES: En 1921 Willis ,basándose en métodos de flotación simple anteriores describió el método que lleva su nombre, el cual dada su sencillez, se puede utilizar en trabajos de campo, ya que para realizarlo únicamente se requiere microscopio y laminillas. Este método se basa en un principio de flotación simple, utilizando una solución de cloruro de sodio de una densidad entre 1.200 y 1.250, en la cual los quistes, huevos y larvas flotan perfectamente.

MATERIAL Y EQUIPO:

·         Vasos de precipitado de 50 ml

·         Tubos de ensaye de 13 X 100 mm

·         Gradilla

·         Abatelenguas de madera

·         Portaobjetos de 26 X 76 mm

·         Cubreobjetos de 22 X 22 mm

·         Microscopio

·         Solución de salmuera o solución saturada de cloruro de sodio

·         Lugol

 

METODO

1.- Se colocan en el vaso de precipitado de 2 a 3 gr de materia fecal, se añade una pequeña cantidad de solución saturada de cloruro de sodio, se homogeniza.

2.- Se vierte en un tubo de ensaye hasta el borde, se coloca el cubreobjetos de tal manera que quede en contacto con la suspensión y se deja reposar durante 15 minutos.

3.- Transcurridos los 15 minutos se toma el cubreobjetos  y se coloca sobre un portaobjetos al cual se le ha puesto previamente una gota de lugol.

4.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X y 40 X.

5.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

 

INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS DE CAVIDAD

 

 

OBJETIVO: Demostrar la presencia de protozoarios flagelados en exudados vaginales y uretrales y en orina por medio de examen directo.

 

GENERALIDADES: Las parasitosis por Tricomonas vaginalis carece de hospedero intermediario. En la transmisión sexual, el hombre funciona como vector y la mujer infectada como reservorio del parásito; la infección es más frecuente en grupos de mujeres donde la higiene es deficiente, siendo el contacto sexual el mecanismo más frecuente por el que se adquiere el parásito; sin embargo se sabe de casos de tricomoniosis que se han adquirido en el momento del parto, por contacto con ropa, toallas, baños, instrumentos de exploración ginecológica u otros objetos contaminados. La presencia del parásito en el tracto urinario del varón pasa inadvertida con mayor frecuencia que en el de la mujer o las molestias son mínimas.

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopio
  • Hisopo
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Tubo de ensaye con sol. Isotónica estéril
  • Espejo vaginal
  • Puente de tinción
  • Pipeta Pasteur con bulbo
  • Aceite de inmersión
  • Colorante de Wright
  • Secreción vaginal, uretral u orina
  • Pizeta con agua destilada

METODO

1.- Se coloca a la paciente en posición ginecológica.

2.-Introducir con cuidado el espejo vaginal.

3.- Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior.

4.- Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido.

5.- La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solución salina conservando a 37°C.

6.- Una vez seco el extendido se procede a teñir con el colorante de Wright de 1 a 3 min.

7.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste último aceite de inmersión.

8.- Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre.

9.- Examinar con objetivos de 10X y 40X.

10.Anotar resultados de observación y hacer dibujos.