HARADA- MORI

OBJETIVO: Realizar cultivo de huevos para obtener desarrollo de larvas y así poder precisar la especie.

GENERALIDADES: Los huevos uncinariformes observados en muestras fecales pueden ser difíciles o imposibles de diagnosticar, mientras que las larvas que surgen de ellos se identifican fácilmente. Un problema práctico frecuente es la diferenciación de las infecciones por Necator de las producidas por Ancylostoma. Para cultivar larvas a partir de huevos, Harada y Mori (1955) describieron un método sencillo y limpio en tubos de ensaye.

MATERIAL Y EQUIPO:

  • Agua Destilada
  • Tubos de ensaye de punta cónica de 15 ml
  • Gradilla
  • Abatelenguas o aplicadores de madera
  • Tiras de papel filtro de 13 X 120 mm
  • Portaobjetos de 26 X 76 mm
  • Cubreobjetos de 22 X 22 mm
  • Pipetas Pasteur con bulbo
  • Sol. De lugol o ácido acético al 20%
  • Microscopio

METODO:

1.- Se extiende una fina película de heces ( de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro.

2.- Se coloca el papel en un tubo de ensaye con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo.

3.- Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28°C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 días añadiendo agua según se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro.

El flujo capilar del agua que sube a través del papel y la película fecal mantiene húmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depósito oscuro. Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de ésta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscópico. La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la película fecal. Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a baño María (50-60°C) o añadiendo una cantidad de ácido Acético al 20%.

 

 

 

                  

 

                             Strongyloides              Necator                Ancylostoma

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            


 

                               

 

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MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE

OBJETIVO: Realizar un método de sedimentación con gran sensibilidad para detectar infecciones leves.

 

GENERALIDADES: En 1917 Carles y Barthelemy describieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde, en 1948 Ritchie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas.

     El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas. Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

 

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopio
  • Centrífuga
  • Tubos de ensaye cónicos de 15 ml
  • Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado
  • Embudos de polietileno
  • Vasos de precipitado de 50 ml
  • Aplicadores de madera
  • Pipetas Pasteur con bulbo
  • Portaobjetos de 26 X 76 mm
  • Cubreobjetos de 22 X 22 mm
  • Solución salina  isotónica
  • Solución de formaldehído al 10%
  • Éter etílico comercial

 

METODO

1.- Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza.

2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.

3.- Se centrífuga la suspensión durante 1 min a 2000 rpm.

4.- Se decanta el sobrenadante  y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min.

6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrífuga durante 2 minutos a 1500 rpm.

8.- Después de centrifugar se observan 4 capas:

a)    éter en la superficial,

b)    un tapón de restos fecales,

c)    formaldehído,

d)    sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos.

10.-Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el  mismo.

11.-Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

12.-Se anotan resultados de observación y hacer dibujos.

 

 

 

INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM

 

OBJETIVO: Conocer los procedimientos de laboratorio útiles en el diagnóstico  del paludismo ya que podemos encontrarlo en forma aislada en nuestro país.

 

GENERALIDADES: El procedimiento para el diagnóstico de protozoos en sangre circulante es el estudio al microscopio de preparaciones en portaobjetos las cuales son la extensión fina y la gruesa. La extensión fina ideal es la que tiene el grosor de una célula y en la que los elementos celulares aparecen algo aplanados. La extensión fina es útil para estudiar detalles de los hematíes y de los parásitos de la sangre, su principal limitación es que la cantidad de sangre presente en la muestra es pequeña.

     La extensión gruesa contiene 6-20 veces más sangre por unidad de superficie que la extensión fina. Es fundamental que no se fije antes de la tinción ya que los hematíes tienen que deshemoglobinizarse durante el procedimiento. La rotura de los hematíes y la pérdida de su hemoglobina permite la visión microscópica de las demás estructuras, incluidos los parásitos sanguíneos, aunque se encuentren en la parte más profunda de la extensión. La extensión gruesa resulta útil para el diagnóstico rápido de las parasitemias demasiado leves para apreciarse en la extensión fina, pero no sirve para estudios anatómicos finos.

     La toma de sangre periférica para Plasmodium vivax y P. Malarie  deben efectuarse cuando el paciente presenta escalofríos para la búsqueda de esquizontes maduros. Para P. Falciparum se debe tomar la muestra después del acceso febril para observar los eritrocitos con varios trofozoitos antes que estos desaparezcan en capilares de órganos internos.

     Con el colorante Giemsa las estructuras se tiñen de la siguiente manera:

Plasmodium: Citoplasma azul o azul grisáceo.

Eritocitos: Azulosos, grisáceos y en ocasiones rosados.

Núcleo de los Leucocitos: Violeta o morado.

Plaquetas: Violeta ligero o rosa pálido.

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopios
  • 2 portaobjetos limpios y desengrasados
  • 1 lanceta desechable
  • Puente de tinción
  • Caja de Petri
  • Pipeta Pasteur con bulbo
  • Torundas de algodón con alcohol al 70%
  • Sol. Colorante de Giemsa
  • Alcohol metílico
  • Aceite de inmersión
  • Agua destilada
  • Algodón
  • Preparaciones teñidas de Plasmodium

METODO

1.-   En cada mesa se seleccionará un alumno, para puncionar el dedo pulgar o el lóbulo de la oreja previa asepsia de la región con alcohol al 70%. Una vez que se evapora el alcohol se realiza la punción, colocando 3 a 4 gotas de sangre en un extremo del portaobjetos y una gota pequeña en el extremo opuesto.

2.- Las 3 gotas se extienden con el canto de otro portaobjetos y la gota se redondea con uno de los ángulos de dicho portaobjetos a dejarla de 1 cm de diámetro.

3.-  Dejar secar las dos preparaciones a temperatura ambiente durante una hora y media, para que se fije bien la gota gruesa.

4.-  Una vez seca la preparación fina cubrir con alcohol metílico durante uno o dos minutos, procurando que no toque el alcohol a la gota gruesa.

5.- Pasado este tiempo, desechar el exceso de alcohol y dejar secar por evaporación.

6.-   Colocar algodón húmedo en la caja de Petri y encima el frotis.

7.-   Cubrir el frotis con colorante de Giemsa.

8.-  Taparlo para evitar que se seque, dejar actuar el colorante durante 10 minutos.

9.    Lavar con agua destilada.

10.  Escurrir y dejar secar.

11.-  Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a este ultimo aceite de inmersión.

12.-  Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

 

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN WILLIS

 

OBJETIVO: Realizar método de concentración por flotación simple.

GENERALIDADES: En 1921 Willis ,basándose en métodos de flotación simple anteriores describió el método que lleva su nombre, el cual dada su sencillez, se puede utilizar en trabajos de campo, ya que para realizarlo únicamente se requiere microscopio y laminillas. Este método se basa en un principio de flotación simple, utilizando una solución de cloruro de sodio de una densidad entre 1.200 y 1.250, en la cual los quistes, huevos y larvas flotan perfectamente.

MATERIAL Y EQUIPO:

·         Vasos de precipitado de 50 ml

·         Tubos de ensaye de 13 X 100 mm

·         Gradilla

·         Abatelenguas de madera

·         Portaobjetos de 26 X 76 mm

·         Cubreobjetos de 22 X 22 mm

·         Microscopio

·         Solución de salmuera o solución saturada de cloruro de sodio

·         Lugol

 

METODO

1.- Se colocan en el vaso de precipitado de 2 a 3 gr de materia fecal, se añade una pequeña cantidad de solución saturada de cloruro de sodio, se homogeniza.

2.- Se vierte en un tubo de ensaye hasta el borde, se coloca el cubreobjetos de tal manera que quede en contacto con la suspensión y se deja reposar durante 15 minutos.

3.- Transcurridos los 15 minutos se toma el cubreobjetos  y se coloca sobre un portaobjetos al cual se le ha puesto previamente una gota de lugol.

4.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X y 40 X.

5.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

 

INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS DE CAVIDAD

 

 

OBJETIVO: Demostrar la presencia de protozoarios flagelados en exudados vaginales y uretrales y en orina por medio de examen directo.

 

GENERALIDADES: Las parasitosis por Tricomonas vaginalis carece de hospedero intermediario. En la transmisión sexual, el hombre funciona como vector y la mujer infectada como reservorio del parásito; la infección es más frecuente en grupos de mujeres donde la higiene es deficiente, siendo el contacto sexual el mecanismo más frecuente por el que se adquiere el parásito; sin embargo se sabe de casos de tricomoniosis que se han adquirido en el momento del parto, por contacto con ropa, toallas, baños, instrumentos de exploración ginecológica u otros objetos contaminados. La presencia del parásito en el tracto urinario del varón pasa inadvertida con mayor frecuencia que en el de la mujer o las molestias son mínimas.

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopio
  • Hisopo
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Tubo de ensaye con sol. Isotónica estéril
  • Espejo vaginal
  • Puente de tinción
  • Pipeta Pasteur con bulbo
  • Aceite de inmersión
  • Colorante de Wright
  • Secreción vaginal, uretral u orina
  • Pizeta con agua destilada

METODO

1.- Se coloca a la paciente en posición ginecológica.

2.-Introducir con cuidado el espejo vaginal.

3.- Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior.

4.- Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido.

5.- La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solución salina conservando a 37°C.

6.- Una vez seco el extendido se procede a teñir con el colorante de Wright de 1 a 3 min.

7.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste último aceite de inmersión.

8.- Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre.

9.- Examinar con objetivos de 10X y 40X.

10.Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

 

INVESTIGACIÓN DE PROTOZOARIOS PULMONARES

 

 

OBJETIVO: Investigar en secreciones pulmonares, presencia de protozoarios.

 

GENERALIDADES: Pneumocystis carinii es un parásito extracelular, que produce neumonía intersticial de células plasmáticas, la cual se observa en niños prematuros, desnutridos, en personas inmunocomprometidas ( SIDA, procesos malignos, inmunosuprimidas por transplantes, etc.) Se considera como un elemento oportunista, pues lo podemos encontrar en el cuerpo humano sin dar lugar a síntomas.

 

MATERIAL Y EQUIPO

  • Microscopio
  • Portaobjetos 25 X 76 mm
  • Aplicador de madera
  • Mechero
  • Puente de tinción
  • Colorante de  Giemsa
  • Sol. Buffer ph 7.0-7.2
  • Aceite de inmersión
  • Frasco con expectoración o material de aspiración bronquial

 

METODO

1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado hacer un frotis de la expectoración.

2.- Dejar secar 5 minutos.

3.- Proceder a teñir cubriendo el frotis con sol. colorante de Giemsa por 30 minutos, escurrir y lavar con sol. buffer, escurrir y dejar secar.

4.- Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a esta última observación aceite de inmersión.

5.- Anotar resultados de observación y hacer dibujos.

METODO DE GRAHAM

OBJETIVO: Encontrar por medio del raspado perianal huevos de Enterobius vermicularis.

GENERALIDADES: Vix en 1860 recomendó por primera vez el uso de una torunda o un raspador anal para obtener material para el examen microscópico en busca de huevos de Enterobius. Graham (1941) y Jacobs (1942) introdujeron independientememnte una técnica de cinta adhesiva de celulosa Scotch para obtener huevos de Enterobius de la región perianal.

     Esta técnica se basa en que la hembra adulta de Enterobius vermicularis habitualmente no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia  las márgenes del ano, depositando los huevos en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la mañana indicando que debe ir a defecar y no debe bañarse.

     Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp.

 

MATERIAL Y EQUIPO

  • Portaobjetos De 26 X 76 mm
  • Abatelenguas
  • Cinta de celulosa Scotch
  • Microscopio

 

METODO

1.-   Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetándola con los dedos pulgar e índice.

2.-  Se presiona la superficie sobre la región perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal.

3.-  Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos .

4.-    Observar con objetivo de 10X.